El microscopio es el ojo que nos permitió descubrir las células, las bacterias y hasta el interior de los átomos (con los electrónicos). Pero no es solo una lupa potente: el principio físico que limita lo que podemos ver se llama límite de difracción, y por eso un microscopio óptico no puede ver objetos más pequeños que unos 200 nanómetros (como los virus). Para ver más pequeño hay que usar electrones en lugar de luz. Te explico cómo funcionan los microscopios ópticos (compuestos) y electrónicos (TEM y SEM), cómo se calcula el aumento y la resolución, y por qué la inmersión en aceite mejora la nitidez.
Aumento vs. resolución: el límite de difracción
El aumento es lo fácil: un microscopio óptico puede ampliar una imagen 1000×, 1500× o incluso 2000×. Pero si aumentas más allá del límite útil, la imagen se vuelve borrosa, no aparecen nuevos detalles. Eso es porque el aumento no crea información; solo la agranda. Lo que realmente importa es la resolución: la capacidad de distinguir dos puntos muy cercanos como separados.
El límite de resolución de un microscopio óptico viene dado por el criterio de Rayleigh: d = 0.61 · λ / NA, donde λ es la longitud de onda de la luz (400-700 nm, promedio 550 nm) y NA es la apertura numérica del objetivo (máximo ~1.4 en aceite). Con NA=1.4 y λ=550 nm, d ≈ 0.61·550/1.4 ≈ 240 nm (0.24 micras). Es decir, dos objetos separados por menos de 240 nm se verán como uno solo. Esa es la razón por la que no podemos ver virus (20-200 nm) ni estructuras subcelulares como ribosomas (20 nm) con un microscopio óptico convencional.
El aumento máximo útil de un microscopio óptico es aproximadamente 1000× la apertura numérica (NA). Con NA=1.4, el aumento útil máximo es ~1400×. Por encima de eso solo obtienes «vacío» (imagen borrosa). Los microscopios de los colegios suelen tener objetivos de 40× (NA 0.65) y ocular 10×, total 400×, que es razonable. Los objetivos de 100× con aceite de inmersión son los únicos que se acercan al límite.
Difracción y el fenómeno de Airy
Cuando la luz pasa a través de una apertura circular (como la lente del objetivo), no se enfoca en un punto perfecto sino en un patrón de difracción llamado disco de Airy. Si dos discos de Airy se solapan más allá del criterio de Rayleigh, la imagen se confunde. Por eso la resolución está fundamentalmente limitada por la física ondulatoria, no por la calidad de las lentes (aunque las aberraciones empeoran la imagen).
Microscopio óptico compuesto: partes y trayectoria de la luz
Un microscopio óptico de campo claro (el típico de laboratorio) tiene los siguientes componentes, en orden desde la fuente de luz hasta el ojo:
La trayectoria: la luz del condensador ilumina la muestra. Los detalles de la muestra (que absorben o dispersan la luz) crean un contraste. La luz que atraviesa la muestra es recogida por el objetivo, que forma una imagen real dentro del tubo. Esa imagen es luego ampliada por el ocular para que el ojo pueda verla. La imagen final aparece invertida (por eso mover la preparación hacia la derecha la desplaza hacia la izquierda en el campo de visión).
Los objetivos y la apertura numérica (NA): la clave de la resolución
La apertura numérica (NA) es el parámetro más importante de un objetivo. Se define como NA = n · sen θ, donde n es el índice de refracción del medio entre el objetivo y la muestra (aire n=1, aceite n≈1.515) y θ es el semiángulo del cono de luz que entra en el objetivo. Un NA alto significa que el objetivo recoge luz de un cono muy ancho, lo que mejora la resolución (porque d = 0.61 λ / NA).
Un objetivo seco (sin aceite) tiene NA máximo de 0.95 (sen θ no puede superar 1). Con aceite de inmersión se alcanzan NA de 1.25, 1.4, incluso 1.45. La relación entre aumento y NA es importante: un objetivo 100× con NA 1.25 tiene una resolución de ~0.27 μm, mientras que un 100× con NA 0.9 (inmersión en agua) solo resuelve 0.37 μm. Por eso los objetivos de inmersión en aceite son imprescindibles para bacterias pequeñas o detalles subcelulares.
Los objetivos modernos son infinitamente corregidos: la imagen se forma en el infinito, y una lente de tubo adicional la enfoca en el plano del ocular. Esto permite insertar accesorios (filtros, divisores de haz) sin afectar la calidad de imagen. Además, incorporan corrección de aberraciones cromáticas (apocromáticos, los mejores; semiapocromáticos; acromáticos los básicos) y de aberración esférica (planos: «plan» en el nombre, como «Plan Achromat»).
| Tipo de objetivo | Aumento típico | NA (seco / aceite) | Resolución teórica (λ=550 nm) | Aplicación |
|---|---|---|---|---|
| Achromat (seco) | 10× | 0.25 | 1.3 μm | Barrido general, tejidos |
| Achromat (seco) | 40× | 0.65 | 0.52 μm | Detalles celulares, núcleos |
| Plan Achromat (seco) | 60× | 0.85 | 0.39 μm | Campo plano, fotografías |
| Plan Fluor (aceite) | 100× | 1.25 | 0.27 μm | Bacterias, mitocondrias |
| Plan Apochromat (aceite) | 100× | 1.45 | 0.23 μm | Máxima resolución, investigación |
Inmersión en aceite: cómo se gana resolución
Cuando usas un objetivo de 100× seco, la luz que sale del cubreobjetos (vidrio n≈1.5) pasa al aire (n=1) y luego al objetivo. En esa interfase vidrio-aire, parte de la luz se desvía por refracción, perdiéndose ángulos altos (el sen θ máximo en aire es 1, pero la luz que sale del vidrio con ángulo >41° sufre reflexión total interna). Con aceite de inmersión (n≈1.515), el aceite tiene el mismo índice de refracción que el vidrio, por lo que no hay refracción en la interfase cubreobjetos-aceite- objetivo. Los rayos de alto ángulo entran en el objetivo, aumentando la NA de ~0.95 a ~1.4.
La técnica: colocar una gota de aceite de inmersión (generalmente aceite de cedro o aceite sintético) sobre el cubreobjetos, y bajar el objetivo de 100× hasta que toque la gota. Luego se enfoca con el tornillo micrométrico. Al terminar, hay que limpiar el aceite del objetivo y del cubreobjetos con papel de lente y un limpiador óptico (nunca disolventes agresivos). La inmersión solo se usa con objetivos específicos (marcados «Oil» o «IMMER»).
La importancia del cubreobjetos (0.17 mm)
Los objetivos de alta apertura (NA>0.6) están diseñados para trabajar con un cubreobjetos de espesor estándar de 0.17 mm (nº 1.5). Si usas un porta sin cubre o con cubre de otro grosor, la aberración esférica degrada la imagen. Algunos objetivos tienen un anillo corrector (collar) para ajustarse a diferentes grosores de cubre. En inmersión, el aceite elimina la interfase vidrio-aire, pero el espesor sigue siendo crítico.
Técnicas de contraste: campo claro, contraste de fases, fluorescencia
Las células vivas son casi transparentes (no absorben luz). Verlas al microscopio de campo claro (el normal) es difícil; se necesitan tinciones que suelen matarlas. Para observación en vivo se usan técnicas de contraste que aprovechan los cambios de fase de la luz al atravesar estructuras con diferente índice de refracción.
- Contraste de fases (Phase Contrast): Inventado por Frits Zernike (Premio Nobel 1953). Un anillo en el condensador ilumina la muestra con un cono de luz hueco. Las estructuras celulares desvían ligeramente la luz (cambian la fase respecto a la luz que no interacciona). Un anillo de fase en el objetivo retrasa o adelanta la luz no desviada, generando interferencia destructiva/constructiva que convierte los cambios de fase en cambios de intensidad (grises). Perfecto para ver células vivas sin teñir.
- Contraste de interferencia diferencial (DIC, Nomarski): Usa prismas de Wollaston para dividir el haz en dos polarizaciones perpendiculares, desplazadas lateralmente una fracción de micra. Al recombinarlas, los gradientes de índice de refracción producen un relieve sombreado que simula imagen 3D. Da más resolución que el contraste de fases, pero requiere equipo caro.
- Fluorescencia: Se tiñe la muestra con fluorocromos (moléculas que absorben luz de una longitud de onda (excitación) y emiten otra más larga (emisión)). Se ilumina con luz de excitación (azul, verde) mediante un filtro dicroico y se observa la luz emitida (rojo, verde) que es mucho más débil. La fluorescencia permite localizar proteínas específicas (anticuerpos fluorescentes), marcar el núcleo (DAPI, Hoechst), o visualizar el calcio (Fluo-4). Es la técnica más potente en biología celular.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM): electrones en lugar de fotones
El límite de resolución del microscopio óptico se debe a la longitud de onda de la luz (400-700 nm). Si usamos partículas con longitud de onda mucho más corta, podemos resolver objetos mucho más pequeños. Los electrones acelerados a altas velocidades tienen una longitud de onda asociada (dualidad onda-partícula, de Broglie) inversamente proporcional a su energía: λ = h / p = h / (m·v). A 100 keV, λ ≈ 0.0037 nm (3.7 picómetros), que es mucho más pequeña que el tamaño de un átomo (~0.1 nm). En la práctica, las aberraciones de las lentes electromagnéticas limitan la resolución del TEM a unos 0.1 nm (1 Å), suficiente para ver átomos individuales en materiales cristalinos.
Un TEM funciona de forma análoga a un microscopio óptico de transmisión, pero con haces de electrones y lentes magnéticas (electroimanes que enfocan los electrones). Proceso:
- Cañón de electrones: Un filamento de tungsteno o hexaboruro de lantano (LaB₆) se calienta (emisión termoiónica) o se usa un cátodo de emisión de campo (FEG) para generar un haz de electrones.
- Condensadores: Lentes magnéticas que enfocan el haz sobre la muestra (ultrafina, de 50-100 nm de espesor).
- Muestra: Debe ser muy delgada para que los electrones la atraviesen. Material biológico se fija, incluye en resina y se corta en secciones ultrafinas (ultramicrotomo).
- Objetivo: Lente magnética principal que forma la primera imagen.
- Lentes intermedias y proyectores: Amplían la imagen y la proyectan sobre una pantalla fluorescente (visible) o una cámara CCD/CMOS.
Los electrones son dispersados por los átomos de la muestra; las regiones más densas (con átomos pesados como uranio, osmio) dispersan más electrones y aparecen oscuras (contraste de masa/espesor). En biología se usan tintes de metales pesados (acetato de uranilo, citrato de plomo) para aumentar el contraste. Las imágenes TEM alcanzan aumentos de 1’000.000× y permiten ver orgánulos como mitocondrias, retículo endoplásmico, e incluso partículas virales individuales.
Vacío y preparación de muestras
Los electrones son desviados por las moléculas del aire; por eso el TEM opera a ultra alto vacío (~10⁻⁵ Pa). Las muestras biológicas deben ser deshidratadas (lo que puede introducir artefactos) o criofijadas (microscopía crioelectrónica, ganadora del Nobel 2017). Además, los electrones de alta energía dañan las muestras orgánicas (radiólisis), por lo que se usan dosis bajas y detectores sensibles. El TEM es caro (500.000 – 5 millones de euros) y operarlo requiere técnicos especializados.
Microscopio electrónico de barrido (SEM): imágenes 3D de superficies
El SEM no forma una imagen por transmisión, sino que barre la superficie de la muestra con un haz de electrones finamente enfocado (de 1 a 10 nm de diámetro) y detecta los electrones secundarios o retrodispersados emitidos por la superficie al ser impactada. La intensidad de la señal en cada punto se convierte en un nivel de brillo en una pantalla, construyendo una imagen de barrido (como un televisor).
Características del SEM:
- Resolución: 1-10 nm (menor que TEM, pero suficiente para ver bacterias, nanomateriales y detalles superficiales).
- Profundidad de campo: Enorme, por lo que las imágenes parecen fotografías 3D.
- Preparación de muestra: Las muestras sólidas (metales, rocas, insectos) solo necesitan estar secas y recubiertas con una capa conductora (oro, platino) para evitar acumulación de carga. Muestras biológicas se fijan, deshidratan, secado por punto crítico y se metalizan.
- Electrones secundarios (SE): Detectan la topografía superficial (más electrones salen de los bordes y crestas, dando sensación de relieve).
- Electrones retrodispersados (BSE): Proporcionan contraste de número atómico (elementos más pesados aparecen más brillantes). Útil para identificar inclusiones minerales.
- Espectroscopía de rayos X (EDS/EDX): El haz de electrones excita la emisión de rayos X característicos de cada elemento, permitiendo analizar la composición química de la muestra.
Los SEM son más accesibles que los TEM (desde 70.000€ hasta varios cientos de miles) y no requieren secciones ultrafinas. Se usan en ciencia de materiales, geología, paleontología (observar fósiles), electrónica (inspección de chips), y biología (ver estructuras de superficie como estomas, tricomas, polen).